Modificaciones genéticas de bacterias lácticas para la producción de alimentos

ÍNDICE
Abstract
Introducción
Objetivos
           General
           Específicos
Plan de trabajo
Metodología
Resultados y discusión
           1. Clasificación de las bacterias lácticas
           2. Situación de la ingeniería genética aplicada a bacterias lácticas
                      2.1 Vectores
                      2.2 Competencia
                      2.3 Clonado
                      2.4 Genes registradores en bacterias lácticas
           3. Inhibición del ataque por fagos a bacterias lácticas
                      3.1 Fuentes de contaminación
                      3.2 Mecanismos moleculares de resistencia a fagos
                      3.3 Mecanismos preventivos en la industria
                      3.4 Aislamiento y caracterización de mutantes resistentes
           4. Producción de bacteriocinas
                      4.1 Diseño de la producción de pediocina PA-1 asociada a la nisina
                      4.2 Otras aplicaciones de bacteriocinas
           5. Mejora en la producción de lactato y aromas en fermentaciones
                      5.1 Producción de diacetilo
                      5.2 Producción de acetaldehido
           6. Modulación de la actividad imunitaria mediada por probióticos
           7. Otras aplicaciones
           8. Fuentes, aislamiento, caracterización y evaluación de probióticos
           9. Perspectivas futuras
Conclusiones
Conclusions
Referencias


ABSTRACT
By the time the acid lactic bacteria (LAB) had been identified as probiotics in 1989, genetic
engineering was a brand-new science with lots of new techniques that allowed the design of LAB
strains able to control the infection from phages and pathogens and enhance some genes useful in
the dairy industry. These strains can activate an inmune response in its host. Moreover they can
provide biophisical and organoleptic properties in the foods present in industry.

In this review, the current engineering applied to the LAB is evaluated, as well as the molecular and
industrial mechanisms against phage attack at the LAB will be described, because nowadays, the
former issue is an important problem for dairy industry. Finally, there are designed some bacteria
producing pediocin PA-1, a food preserver, and finally, there are suggested some future perspectives
and benefics provided by LAB.

Keywords: lactic acid bacteria, probiotics, inhibitory proteins, lactic acid.

INTRODUCCIÓN
Las bacterias lácticas (BAL) son un grupo heterogéneo de bacterias gram-positivas (Gram-(+))
clasificado por su fenotipo, que es producir ácido láctico a partir de la fermentación de azúcares de
componentes alimentarios como la glucosa. Son, por tanto, bacterias indispensables para la
producción de alimentos fermentados, especialmente lácteos, productos cárnicos, panarios, y otras
bebidas fermentadas como el vino. Hay hasta de órdenes filogenéticos diferentes, y unas producen
ácido L-(+)-láctico, y otras D-(-)-láctico.

Las BAL que viven en el intestino humano, y controlan el balance de su microbiota con efectos
fisiológicos y beneficiosos sobre la salud, reciben el nombre de probióticos. Algunos tipos de
probióticos se recogen en la figura 1.

Las BAL como probióticos, por tanto, son
microorganismos vivos que proveen beneficios a
su hospedador ingeridos en cantidades
adecuadas(2), por lo que son consideradas como
GRAS (Generally Recognised As Safe)(1). La
figura 2 recoge un diagrama de flujo para
considerar a un microorganismo como probiótico. Figura 1: Tipos de probióticos(1).

Su importancia en la mucosa gastrointestinal reside en que ésta tiene una gran variedad de
funciones, como por ejemplo proteger al hospedador de infecciones patógenas, o proveer un hábitat
para bacterias intestinales útiles. Gracias a la ingeniería genética, y debido a la inocuidad de las
BAL, es especialmente útil transferirles genes de otros organismos que aporten un fenotipo
deseable. Para ello se consideran diferentes sistemas vector-hospedador.

Entre las aplicaciones de las BAL en la industria láctea, podemos destacar la producción de
bacteriocinas(3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13), diacetilo(14, 15, 16), su modulación de la respuesta
inmunitaria(1, 2, 17, 18), producción de lantibióticos(14), inhibidor de la enzima convertidora de
angiotensina(5), y multitud de otros aditivos(14). En la figura 3 se recogen algunos mecanismos de
acción de los probióticos.

En ellas pueden expresarse además genes no sólo del ámbito que nos atañe de la alimentación, sino
de cualquier ámbito en el que sea útil su fermentación autónoma, como para hacerlas resistentes a
fagos(19, 20, 21, 22, 23), según se verá más adelante.

OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
La finalidad de esta memoria es revisar diversas estrategias para la modificación genética de
bacterias productoras de ácido láctico, así como identificar sus aplicaciones en la industria de la
alimentación. Particularmente, se presta atención a las variedades de bacterias probióticas que
permiten la producción de alimentos específicos, o que desempeñan una función beneficiosa local o
sistémica para el huésped.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
– Revisar el repertorio de BAL útiles en alimentación.
– Evaluar los avances de la ingeniería genética asociados a la producción de nuevos alimentos
gracias a la utilización de BAL y las características de sus vectores tanto crípticos como
mejorados y nuevos vectores.
– Identificar los genes de interés potencial en alimentación que pueden ser transfectados y
expresados en BAL.
– Citar ejemplos de aplicaciones específicas de herramientas bioquímicas útiles para el
desarrollo de BAL de interés para la alimentación, como es dotar resistencia a fagos,
producir bacteriocinas, ácidos orgánicos, aromas, o péptidos de interés, asñi como bacterias
probióticas con propiedades mejoradas incluyendo la estimulación del sistema inmunitario.

PLAN DE TRABAJO
En primer lugar, se eligió realizar un tabajo fin de grado cuya finalidad sería elaborar una revisión
bibliográfica sobre bacterias lácticas aplicadas a la alimentación, desde un punto de vista
bioquímico.

Para ello, se enfocaron los trabajos de seminario de asignaturas relacionadas con esta temática a
priori de la memoria, para tener conocimientos multidisciplinares desde la virología, la biología
molecular de la alimentación y la ingeniería de proteínas.

Una vez comenzó el cuatrimestre en el que se asigna la elaboración de esta memoria, se concertó
una cita con el tutor para definir los objetivos y patrones de búsqueda, así como para establecer una
serie de citas de seguimiento en la elaboración de esta memoria.

De forma sistemática y razonada, se redactaron resumenes de las fuentes más relevantes, y con
ayuda de las tutorías de seguimiento, se fue definiendo la estructura y el contenido de la presente
memoria.

METODOLOGÍA
Se buscaron revisiones o ''reviews'' con la base de datos Scopus, conteniendo la palabra ''lactic acid
bacteria'', y ''cloning''. Primero desde 2002, para situar el contexto del surgimiento de los
probióticos(1). Aparecieron sólo 8 resultados de búsqueda, de los cuales se tomaron los artículos que
componen las refs. 1 y 24. A continuación se buscaron artículos con las palabras clave ''lactic acid
bacteria AND genetic food'' publicados en 2014, de los que se tomaron las refs. 4, 5.
Respecto al apartado de resistencia a fagos, se utilizó la ecuación ''acid lactic bacteria'' AND
''phage'' en artículos desde 2004, apareció un artículo en la base de datos Embrapa (ref. 25) que
referenciaba a un artículo muy citado (ref. 26), del cual se tomó gran parte del trabajo, junto a
artículos relacionados (refs. 19, 22, 26, 27, 28 y 29). Luego se editaron algunas figuras de las refs.
21, 27, 30 y 31.

Para elaborar el apartado de la pediocina, se utilizaron también bases de datos de secuencias y de
proteínas, programas de edición de secuencias como EMBOSS y figuras hechas a mano a partir de
datos en publicaciones. Las bases de datos de secuencias y de proteínas utilizadas componen las
refs. 12, 32 y 33. El programa EMBOSS es la ref. 34.

También se han buscado imágenes de artículos científicos desde Scopus y el buscador de PubMed
(refs. 1, 2, 3, 10, 12, 15, 21, 26, 31, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42). El procesado de los textos
científicos, por otra parte, se diseñó un programa informático con Lazarus, a disposición de quien lo
solicite al autor de este trabajo fin de grado, en el que se procesa el espaciado de las publicaciones
para dejarlas en texto plano y en cómodos párrafos, para ser leídos en documentos de texto aislados.
Para ampliar pequeños matices de apuntes de clase respecto a la producción de diacetilo, se hizo
una búsqueda concreta con Google Académico en un par de artículos.

Las refs. 43 y 44 se obtuvieron desde Google Académico.

Todas las referencias fueron procesadas con el programa informático compiado desde Lazarus. De
forma adicional, se usaron apuntes de clase aportados por el tutor de este trabajo fin de grado (ref.
14), así como artículos referentes a probióticos de su grupo de investigación (refs. 2, 3) y de Scopus
como motor de búsqueda para el 80% de los artículos citados.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS LÁCTICAS
La clasificación filogenética que impera desde hace años la recogen los tomos de Bergey's of
Systematic Bacteriology, aunque hace unos 20 años se estableció una clasificación diferente de las
bacterias, en concreto por el tipo de hidrato de carbono que fermentaban(45).

Hay BAL con propiedades funcionales características de la cepa a la que pertenezcan, debido a la
variabilidad genética entre ellas. Algunas BAL definen las diferentes variedades de productos
lácteos fermentados, como por ejemplo quesos, cuya textura y características sensoriales están muy
influenciadas por la población de microorganismos, sobre todo de BAL mesofílicas(24).

Otras, por ejemplo, pueden usarse para producir azúcares simples a través de la digestión de
oligosacáridos. Hay BAL incluso en la leche materna, donde determinadas cepas pueden fermentar
sus oligosacáridos complejos, y son consideradas como prebióticos (un prebiótico es un nutriente,
en este caso un hidrato de carbono, producido por un probiótico)(14).

Las BAL encontradas durante la maduración del queso, son referidas colectivamente como BAL no
iniciadoras (NSLAB). Son especies involucradas en la formación de sabor y su composición varía
con los procesos aplicados a la leche y con la edad del queso. Son más frecuentes en quesos hechos
con leche cruda que en leche pasteurizada, y dominantes en muchos quesos madurados(24).

Actualmente las más utilizadas en alimentación son de los órdenes Lactobacillus sp.,
Bifidobacterium sp., Lactococcus sp., Enterococcus sp., y Streptococcus sp.

El grupo de BAL denominado Lactobacillus acidophilus, en el cual destacan Lb. salivarius, Lb.
casei, Lb. plantarum, Lb. fermentum(16), Lb. reuteri y Lb. brevis, es el más frecuentemente aislado
en el intestino humano(1).

Hay cepas comerciales de Lb. delbrueckii (figura 4) sensibles a fagos, de importancia para el
sistema inmunitario debido a su comprobada inducción de IgA en ratones. Según la cepa, tiene
diferente tolerancia a sales biliares, lisozima y condiciones ácidas (aunque todas sobreviven a pH 3,
que es el grado de acidez medio de la mucosa gástrica), lo que
afecta a la viabilidad celular de 2 a 4 órdenes de magnitud(46).

Muchas cepas de Bifidobacterium sp., han sido usadas durante
milenios en productos de leche natural y fermentada con la
acertada esperanza de que sirviesen como probióticos por su
supervivencia y crecimiento en el tracto gastrointestinal. Aún en
la actualidad, se añaden como cultivo adjunto en productos de
alimentación debido a su potencial para mantener el balance de salud intestinal. Sus grupos son
clasificados filogenéticamente y por la composición de su pared celular (PC) en 6 subgrupos(1).

Encontramos especies como B. breve, B. infantis - presente en preadolescentes -, B. liberorum, B.
longum - porque tiene fragmentos genéticos largos-, y B. animalis(14). Pese a esta diversidad y su
uso milenario, las bifidobacterias aún están pobremente estudiadas a nivel genético, en comparación
con otros microorganismos de interés industrial(47).

También hay Propionibacterium sp. que generan burbujas de CO2 en diversos tipos de quesos como
gruyer y emmental, gracias al dióxido de carbono resultante de la fermentación(14), pertenecientes
junto a las Bifidobacterium a la subclase de Actinobacteridae(45).

Lactococcus lactis subsp. lactis (figura 5) y sus biovariantes Lc diacetylactis, y Lc. lactis subsp.
cremoris, son usados ampliamente tanto en biotecnologías aplicadas modernas, como en la
producción de quesos, mantequillas y leches fermentadas, con unos registros de seguridad
excelentes. Rara vez se asocian con infecciones, y han sido considerados GRAS(1).

En Lactococcus lactis se ha estudiado uno de los mejores sistema caracterizados de resistencia
natural a fagos, el Sie2009, que confiere resistencia al grupo 936 genéticamente distinto de fagos(28).
Dicho sistema se ha identificado en el genoma del fago
atemperado Tuc2009, y encontrado posteriormente en otros
profagos en los genomas de varios de sus cepas(28).

Las especies de Enterococcus sp. son una parte relevante de las
comunidades microbianas de quesos artesanales, influenciando
las características sensoriales del producto final(24).

En cuanto a Stereptococcus sp., merece una especial mención Figura 5: Lc. lactis en división(40).
S. thermophilus (figura 6) por ser una de las LAB termofílicas más importantes en la industria
láctea. Se ha observado que posee una baja tasa de mutaciones generadoras de bacterias mutantes
fago-resistentes.

Streptococcus cremoris es una especie de BAL con la peculiaridad de que su sistema de
restricción/modificación (R/M) de fagos no está codificado por
plásmidos. No obstante, la mayoría de cepas presentan
plásmidos, excepto el isoesquizómero ScrFI - Lla4971 de esta
especie, asociado a las características fenotípicas de la cepa(26).

2. SITUACIÓN DE LA INGENIERÍA GENÉTICA APLICADA A BACTERIAS
LÁCTICAS
La ingeniería genética es la tecnología del control y transferencia de DNA de un organismo a otro, y
permite la producción directa de pequeñas moléculas en bacterias(6). En la actualidad, es posible
insertarles genes a BAL mediante vectores plásmídicos, siempre que sean células competentes, y
una vez introducido, clonarlas para conseguir cepas iniciadoras de interés industrial. Finalmente, se
pueden identificar en el producto lácteo deseado, y aportar las características deseadas(50).

2. 1. Vectores de bacterias lácticas
Para que el DNA recombinante se mantenga en la nueva célula hospedadora, debe ser o bien capaz
de replicarse e integrarse en el cromosoma, o estar embebido en un plásmido circular cerrado
covalentemente, como ocurre en la mayoría de ocasiones. Se hará una especial mención a los
plásmidos de especial interés para la transfección de genes a BAL: plásmidos promiscuos,
autotransmisibles, duales, crípticos, y por último a los cósmidos.

Los plásmidos promiscuos, originariamente denominados plásmidos autotransmisibles, transfectan
a un rango de bacterias Gram(-) en las que se mantienen de forma estable, como es el caso de los
plásmidos α IncP RP4, RP1 o RK2 (anexo 1). Los plásmidos autotransmisibles se han identificado
en multitud de géneros de bacterias Gram(+), y su tasa de transferencia es menor que la de Gram(-),
posiblemente debido a que tienen una pared celular (PC) más simple(6).

Los plásmidos duales, también conocidos como plásmidos de amplio espectro, son plásmidos
mixtos construídos desde una especie convenientemente de crecimiento más rápido que las BAL,
por ejemplo Escherichia coli, y la BAL de interés donde queremos expresar el gen que porta el otro
plásmido. Un ejemplo es pBR332. Tienen la ventaja añadida de ser integrables en los especies
donde se encuentran ambos plásmidos(14).

Los plásmidos crípticos son plásmidos que no tienen un efecto aparente en el fenotipo de la célula
hospedadora, pero se replican y transmiten a otras células. Pueden utilizarse para portar genes de
resistencia a fagos, como la nisina(48).

Pese a las ventajas que aportan los plásmidos, aún pueden realizar una transferencia genética
inestable(6) en sistemas de defensa donde hay tanto cepas muy vulnerables a su fago como cepas
resistentes. Éste problema es conocido como inestabilidad segregacional: hay células que, al
dividirse, pueden aportar los 2 plásmidos a una sola célula hija, y a la otra ninguno(14).

Esto conlleva a que en una línea celular no dotan de resistencia al fago añadir al plásmido los genes
de la conjugación mob, gracias a los cuales se forma un puente entre las células hijas y se evita la
segregación del plásmido(14).

Otro tipo de vectores de interés son los cósmidos (figura 7). Son
plásmidos que se empaquetan en partículas de fago λ portadoras
del gen cos, cuyo DNA recombinante se inyecta y circulariza
como un fago, pero se replica como un plásmido normal sin la
expresión de las funciones fágicas indeseables. Proveen una
forma eficiente de clonar grandes fragmentos de DNA, y
permite unir varios fragmentos de genoma para contener clones
que originariamente no se encontraban en el hospedador(6).

2. 2. Estado de competencia de bacterias lácticas
En cuanto a la competencia de las BAL a transfectar, es un fenómeno transitivo que existe en
muchas especies de forma natural. Puede ser dependiente de secuencia, e involucra la unión de la
nucleasa al dúplex de DNA y la degradación de una de las 2 cadenas, por lo que sólo puede entrar
una cadena lineal en la célula. Un método para mejorar su mantenimiento es formar híbridos de
plásmidos heterólogos con plásmidos que se encuentran en la BAL hospedadora en la naturaleza(6).

Pese a ser fácil que entre el DNA a un huésped competente mediante técnicas como la transfección
con calcio (Ca2+) en frío de enterobacterias como E. coli, al tener las BAL una pared más grande
porque son Gram(+), la forma de transformarlas es difícil(14).

2. 3. Clonado de bacterias lácticas
Una vez las BAL son competentes, puede ser clonado el gen de interés en su interior. Para ello hay
tres requisitos indispensables. Primero, necesitamos identificar un método para introducir el DNA
de interés en el receptor potencial, como la transformación, la conjugación (figura 8) y la
electroporación(49). Seguidamente, el DNA introducido debe ser mantenido en el nuevo hospedador,
en forma de replicón, o a través de un plásmido donde se introduzca el gen de interés, que debe
integrarse en el genoma de la BAL hospedadora mediante el ciclo lisogénico del plásmido(6).

Finalmente, el uso y mantenimiento de los genes clonados sólo
será detectado si se expresan. Para clonar en bacterias Gram(+)
no entéricas, por tanto, se necesitan plásmidos de un hospedador
intermedio como puede serlo E. coli(6), en cuyo caso estaríamos
realizando una expresión heteróloga del gen de interés.

Un ejemplo para transfectar BAL es la posibilidad de hacer
esferoplastos o protoplastos hidrolizando enzimáticamente la PC
de la Gram-(+) en cuestión, que luego se regenera. Con sólo su
membrana plasmática desnuda, dejan de ser bastoncillos o cocos,
y se vuelven esféricos debido a su mayor estabilidad. Entonces puede inyectársele DNA mediante
los métodos citados previamente(14).

2. 4. Genes registradores en bacterias lácticas
Para identificar a BAL en el producto lácteo deseado, se han desarrollado recientemente una gran
cantidad de herramientas moleculares aplicadas a detectar la abundancia tanto cualitativa como
cuantitativa de genes de BAL, y a evaluar cómo interaccionan éstas con el medio ambiente(14).

Para el marcaje, ha de cuidarse no usar genes de resistencia a antibióticos en alimentación como la
ampicilina, porque podría transmitirse a otras bacterias, y dejarían de ser GRAS. Se podría sin
embargo usar como marcador el gen para la proteína fluorescente verde (GFP)(14). Dicha GFP
permite la evaluación en tiempo real de especies de Bifidobacterium, in vivo. Excita a un cofactor
de flavin-mono-nucleotido (FMN) denominado evoglow-Pp1, fluorescente tanto en condiciones
aerobias o anaerobias(47).

El vector reportero utilizado con la GFP, pNZ:Tu-GFPana, se basa en que el plásmido pNZ8048
hospeda un promotor de Bifidobacterium sp., el factor de elongación EF-Tu de B. longum CECT
4551. pNZ:Tu-GFPana fue construido y plegado, analíticamente de forma estable y funcional, en B.
longum CECT 4551 y en cepas intestinales de B. breve INIA P734(47).

Aparte de éste promotor, o el del fago T7 en el caso de los cósmidos, se pueden utilizar vectores ya
presentes en las bacterias, como el de la β-galactosidasa(16). Diversas técnicas de detección de BAL
en productos fermentados se describen en la siguiente tabla(24).

Basándonos en el conocimiento actual de la regulación metabólica, podemos predecir que los
cambios en las cepas mejoradas pueden involucrar la eliminación de controles alostéricos y
limitantes de la transcripción; la mejora de la cinética enzimática; la inhibición genética de rutas
metabólicas (por ejemplo, diseñando bacterias auxótrofas resistentes a un antimetabolito tóxico que
añadimos al medio. Este inhibe alostérica y específicamente al centro activo de la primera enzima
de una ruta metabólica no deseada); la mejora del uso de carbono en el metabolismo primario del
metabolismo central; y la mejora del transporte del producto fuera de la célula(6).

Un ejemplo útil de genes registradores en BAL es el secuenciado de genes codificantes para la
subunidad 16S de los RNA ribosómicos (rRNA) de comunidades de BAL en productos lácticos
como quesos. Muchas investigaciones se han basado en el análisis de éste rRNA y sus genes
codificantes, de forma satisfactoria(24).

3. INHIBICIÓN DEL ATAQUE POR FAGOS A BACTERIAS LÁCTICAS
La presencia de fagos en cultivos de BAL es a veces inevitable, ya que la leche pasteurizada no es
estéril ni aséptica. Sus fagos dispersos, puede bajar o incluso detener la producción ácida en BAL,
con la consecuente pérdida económica(25, 26).

Teniendo en mente la ubiquidad y diversidad de fagos
en cuanto a las posibles dificultades que se puedan
generar en la fermentación, es más asequible intentar
controlarlos eficientemente en lugar de su completa
eliminación(26). Varios fagos se muestran en la figura 9.

Las fermentaciones con Lc. lactis, y recientemente
Streptococcus thermophilus, son atacadas con
frecuencia por dichos fagos. Para proteger a estos
cultivos iniciadores útiles en alimentación, es crucial
el conocimiento de sus fagos infectivos, la interacción
de éstos fagos con el hospedador, los mecanismos de
defensa a fagos que afectan a fermentaciones
industriales y el desarrollo de mutantes insensibles a
fagos (BIMs)(26).

A nivel de la mucosa intestinal, hay cepas comerciales
de Lb. delbrueckii sensibles a fagos de importancia
inmunitaria debido a su comprobada inducción de IgA
en ratones.

3.1. Fuentes de contaminación
Los fagos pueden provenir de diversas fuentes. Cualquier ingrediente natural que entra en una
instalación de fermentación puede contener fagos, aunque a niveles bajos. Entre ellos se encuentran
la leche cruda, los sueros, el cultivo iniciador y el aire.

La leche cruda es tanto un nicho ecológico de algunas BAL como de fagos. Dado que se obtiene de
diferentes granjas, la biodiversidad fago se amplifica en silos de leche. Además los fagos se pueden
propagar fácilmente en este medio líquido y en medios de tipo gel. Por tanto, se necesitan sólo unas
pocas células sensibles a aumentar rápidamente los niveles de fagos en un entorno determinado(50).
Se han detectado fagos de Lactococcus sp. y Streptococcus sp. mediante una PCR múltiple en el 37
% de las muestras de leche utilizadas para la producción de yogur en España, especialmente de Lc.
lactis. Estos números pueden ser más altos en las muestras de suero de leche o productos finales, ya
que los fagos se pueden propagar durante la mayoría de los procesos de fermentación. Se han
titulado hasta 109 UFC/mL de suero de queso(50).

Cuando un fago atemperado entra en una cepa iniciadora, puede iniciar el ciclo lítico en lugar del
lisogénico. Diferentes tensiones bacterianas tales como calor, sales, antimicrobianos, la falta de
nutrientes o UV pueden inducir el profago y desencadenar el ciclo lítico(50).

Finalmente, otra vía de difusión de contaminantes puede ser aérea, que es más complicada de
identificar. La mayor cantidad de leche procesada diariamente se da en cubas abiertas para producir
queso, y junto al procesamiento de suero de leche, se forman inevitablemente aerosoles y
salpicaduras que pueden exponer a fagos. Cinco muestras de aire fueron probados recientemente en
una fábrica de queso y se encontrarion fagos en las muestras de lactococos, utilizando qPCR(50).

3.2. Mecanismos moleculares de resistencia a fagos
Para facilitar el estudio de los métodos empleados para evitar las contaminaciones por fagos en la
industria, este apartado se estructura en mecanismos moleculares, los cuales están recogidos en la
figura 10, y en métodos preventivos de la industria.
Hay BAL mutantes por selección natural capaces de mejorar la
resistencia a fagos, y de inmunoestimular a la mucosa gástrica.
Además, se ha sugerido que las proteínas de la leche actúan de modo
protector, mientras que una mayor concentración de sal o grasa
no aumenta la resistencia de los fagos al calor(26). Todo esto
hace a las BAL buenas candidatas para aplicaciones industriales en
alimentos funcionales(20).

3.2.1. Interferencia con la adsorción de fagos, e inhibición de la inyección de DNA
El ciclo infectivo de los fagos se inicia con su adsorción a la superficie celular, y la entrada de su
material genético a través de membrana por inyección en el citoplasma de la célula hospedadora. La
interferencia en los pasos iniciales como la adsorción, se ha estudiado en Lactococcus sp. Los
mecanismos más destacados son el sistema Sie2009 y similares, y los genes de resistencia
codificados por los plásmidos pME0030, pCI528, pSK112, pKC50 y pNP40. Desafortunadamente
sólo se ha estudiado la naturaleza genética o química de las mutaciones del plásmido pNP40. El
resto deberían ser caracterizadas a nivel molecular(26).

Hasta el 2010, sólo se han identificado unos pocos ejemplos de mecanismos que inhiben la
inyección de DNA de fago en bacterias Gram-(+). La mayoría fueron identificados en Lc. lactis. El
mejor sistema caracterizado, como ya se comentó previamente, es Sie2009, diseñado para el fago
Tuc2009, cuyos efectos se visualizan en la figura 11. Éste confiere resistencia a nivel de membrana
a un grupo genéticamente distinto de fagos de Lactococcus sp. (el grupo 936) predominante en
cepas de Lc. lactis específicas de la industria láctea(28).

Los sistemas Sie proporcionan resistencia al inhibir la transferencia de DNA del fago al genoma de
la BAL hospedadora, y fueron identificados tanto en el genoma del fagoatemperado de
Lactococcus sp., Tuc2009 y fueron identificados tanto en él, como en otros profagos en los
genomas de varios cepas de Lc. lactis(28).

Un sistema similar a Sie se ha descubierto recientemente en el profago de S. thermophilus, otra
especie de bacterias utilizadas en procesos industriales de fermentación láctica. El profago TP-J34
codifica para la lipoproteína LTP, que bloquea la inyección del DNA del fago en la célula, y
confiere resistencia a algunos fagos de Lactococcus sp. cuando se transforma en Lc. lactis(28).

Respecto al plásmido pNP40, caracterizado a nivel molecular, se ha comprobado que codifica para
una proteína de membrana que evita la penetración del DNA del fago de cabeza alargada c2. La
proteína de infección del fago, por su parte, es referida como pip, y recientemente se ha visto que
cuando un mutante espontáneo resistente a fagos de Lc. lactis c2 se transforma con un plásmido
recombinante con pip, la sensibilidad a fagos se recupera(26).

Podemos por tanto diseñar un mutante del gen pip, que se ha demostrado que provee de una
resistencia completa al fago c2, que no afecta al crecimiento celular en cepas de Lc. lactis, aunque
no es válido para luchar contra los fagos P335, 936 o 949(26).

3.2.2. Infección abortiva
La infección abortiva (Abi) es un mecanismo de resistencia natural a fagos previo a la adsorción y a
la inyección del DNA fágico. Los sistemas de Abi proporcionan resistencia a los fagos mediante la
muerte celular masiva. Son muy diversos, se han descrito hasta 23 en Lactococcus sp(22). Se pondrá
como ejempo AbiV.

Con la caracterización fenotípica en Lactococcus sp. (donde se encuentran la mayoría de
mecanismos de Abi junto a E. coli) se demostró con la Abi una reducción en la eficiencia de las
placas del fago (EOP) unas 9 órdenes de magnitud, en su tamaño, en la eficiencia de los centros de
infección (ECOI). Además, las resistentes a la Abi mueren nada más infectarse, limitando la
propagación del fago(22).

Su estudio, sin embargo, varía en función de la especie en concreto de Lactococcus sp., pues así lo
hace el tipo de fago afectado, la regulación, el tamaño, la naturaleza, y la cantidad necesaria para
alcanzar actividad de la proteína de Abi, aunque el %G+C es similar entre Lactococcus sp.con Abi.
Algunos sistemas en estudio son AbiD1, AbiK, AbiP y AbiZ. Más ejemplos de Abi en el anexo 2 (26).
El más novedoso es AbiV, un sistema que puede transferirse de forma natural entre Lc. Lactis, y que
a diferencia de la mayoría de sistemas Abi (que son plásmidos codificados), está codificado
cromosómicamente. Es silencioso en Lc. lactis MG1363 pero puede ser espontáneamente activado
debido a la reorganización de la región promotora. La secuenciación del genoma completo de los
mutantes de fago insensibles a AbiV reveló una mutación en un gen llamado sav, que codifica para
el polipéptido SaV. Su sobreexpresión produce un efecto tóxico a la células rápidamente, pero si el
fago no puede generar SaV, el sistema AbiV no funciona(22).

3.2.3. Restricción y modificación
Los sistemas de restricción/modificación (R/M) son sistemas naturales de defensa a fagos que
reconocen una secuencia nucleotídica específica, incluyen metilasas que modifican el sitio de
reconocimiento del fago por parte de la BAL hospedadora, y una endonucleasa de restricción
digiere de forma sitio-específica el DNA no modificado. Sirven como defensa a fagos limitando la
adquisión del plásmido por transformación y conjugación, aunque no electroporación. Muchos
fagos, en contra de lo que podría intuírse, utilizan los sistemas R/M para ser replicados, o desarrolan
resistencia a los mismos(26).

Existen 3 tipos de dianas que afectan al DNA viral en los sistemas R/M: la inhibición de su
replicación y transcripción, la interferencia con las proteínas fágicas en su síntesis y ensamblaje, y
la inferferencia con la lisis bacterial inducida por el ciclo lítico del fago. Algunos ejemplos de
especies con dichos sistemas son S. cremoris, S. thermophilus, Lb. helveticus, y Lactococcus sp. Se
exponen diferentes ejemplos de sistemas R/M en Lc. lactis en el anexo 3, y técnicas de biología
molecular para sistemas R/M en el anexo 4(26).

Tras un análisis de la amplificación aleatoria por DNA polimórfico (RAPD-PCR) se han
caracterizado 100 mutantes espontáneos resistentes a fagos a partir de 9 cepas comerciales de S.
thermophilus potencialmente mejoradas para su uso industrial. La naturaleza de su resistencia fue
integrar el fago por lisogenia (su genoma puede integrarse en el cromosoma bacteriano y seguir su
multiplicación) desde mecanismos R/M(27).

Para mutantes resistentes de la cepa I49 de S. thermophilus y con el fago Ψ49 se encontraron fagos
libres en el medio capaces de infectar a la cepa parental pero no I49. Esto sugirió que el fenotipo
resistente podía estar ligado a la integración del fago en el genoma de S. thermophilus, generando
un posible mecanismo de resistencia anti-fago asociado a la lisogenia. Este mecanismo es común en
lactococci y lactobacilli, pero no se había encontrado en S. thermophilus.

3.2.4. Sistema antifago CRISPR/Cas
Un interesante sistema natural antifago es el CRISPR/Cas, encontrado en E. coli en 1987, que le
ofrece resistencia a fagos a S. thermophilus. CRISPR proviene de las siglas de “Clustered regularly
interspaced short palindromic repeats“, o loci con repeticiones palindrómicas cortas agrupadas
regularmente a lo largo de varias proteínas Cas (CRISPR-associated). Representan una
manifestación común del sistema inmunitario en eubacterias y arqueas(30).

Los loci CRISPR evolucionan a
través de la incorporación de
espaciadores, o secuencias de DNA
corta, derivados principalmente de
DNA extracromosómico, tales como
fagos o secuencias de plásmido.                          Figura 12. Locus de los genes CRISPR(30).

La composición de los locus de CRISPR está ilustrada en la figura 12. Un transcrito CRISPR se
escinde por las repeticiones de proteína Cas con o sin otras proteínas del huésped para producir
RNAs pequeños. Estos pequeños RNAs maduros y proteínas Cas, guían y cortan en una secuencia
patrón el DNA invasor para garantizar la defensa celular. Éste sistema es potencialmente útil contra
cualquier tipo de fago.

3.3. Mecanismos preventivos en la industria
La industria láctea ha desarrollado una serie de precauciones y métodos para reducir la
susceptibilidad al ataque por fagos: la desinfección habitual del instrumental, el diseño de cepas
resistentes a múltiples fagos y su rotación, la propagación de cultivos iniciadores en medio inhibidor,
el uso de membranas para separar los componentes de suero de leche (retienen fagos por
ultrafiltración y/o microfiltración(50)) y el cerrado de los tanques tras la inoculación directa de las
BAL(26).

3.3.1 Desinfección del tanque de fermentación
Para la desinfección del tanque, resulta útil calentarlo, pues puede reducir en gran medida la
actividad de partículas de fagos al liberar el DNA y cambiar su morfología. Sin embargo, se sabe
que muchos fagos de LAB no se inactivan por procedimientos de pasteurización clásicos. También
puede reducirse sustancialmente la cantidad de fagos de un tanque, por el efecto de las altas
presiones dinámicas (100 MPa y superiores). Sin embargo, los efectos son variables incluso en el
mismo grupo de fagos(26).

Hay numerosos biocidas que actúan como desinfectantes. Entre ellos destacan el ácido peracético,
seguido del etanol, isopropanol e hipoclorito de sodio, éste último con efectos más variables. Otros
biocidas utilizados son NH4Cl (3%, pH 10.5), espuma de cloruro alcalino (2.5%, pH 12.4),
nonilfenol etoxilado + H3PO4 (0.8%, pH 2.0)(26).

Idealmente, un buen desinfectante se debe utilizar en la concentración adecuada teniendo en cuenta
efecto/coste, con una rápida actividad (menos de 2 minutos para al menos un 99% de inactivación.
En Lb. delbrueckii se ha conseguido esta tasa de éxito) en presencia de materiales orgánicos y con
una actividad frente a un amplio rango de fagos de LAB. Aún así, el mecanismo de acción de los
biocidas está poco estudiado(26).

3.3.2 Rotación de cultivos
La rotación de cultivos es la piedra angular de un sistema de control de fagos eficiente, sobre todo
en la elaboración de quesos, debido a la posible amplificación recurrente en fermentaciones. Es
necesario realizar un seguimiento riguroso de posibles nuevos fagos mediante PCR, así como su
gama de huéspedes por ensayos microbiológicos, y analizar cuidadosamente la sustitución de una
cepa resistente por otra para que las características deseadas se mantengan (porque los fagos pueden
desarrollar mutaciones y así infectar a bacterias que en teoría eran resistentes)(26).

Para diseñar fermentaciones con cultivos iniciadores diferentes, por ejemplo, se puede utilizar de
forma segura el suero resultante de una fermentación de queso cheddar con cepas iniciadoras
mesófilas, en la fabricación de yogur o queso en un proceso que requiere cultivos termofílicos.
Además, el uso de productos lácteos concentrados de otra planta de productos lácteos (que puede
utilizar cultivos iniciadores diferentes) puede ofrecer una protección adicional. Aunque este último
también muy probablemente aumentará la biodiversidad del fago dentro de la fábrica(50).

Dependiendo de las frecuencias de los ataques de fagos y el tamaño de las instalaciones, puede ser
aconsejable analizar la leche (u otros ingredientes) para la presencia de fagos antes de comenzar el
proceso de fermentación una vez hemos “rotado“ la cepa resistente, para confirmar que la carga
inicial del fago no representa un riesgo significativo de insuficiencia de fermentación(50).

3.3.3. Medios de cultivo inhibidores
En cuanto a los medios de cultivo inhibidores de fagos (PIM, por su sigla en inglés), se han
comercializado en su mayoría como anticuerpos (Acs.), DARPins (figura 13), y tampones que
secuestran cationes divalentes (fundamentalmente Ca2+) como los citratos y los fosfatos. Éstos
últimos son también reguladores del pH(23).

Los Acs. son capaces de neutralizar fagos. Se estudiaron dos tipos de Acs. en Lc. paracasei. Uno
tenía como objetivo la proteína principal de la cápsida, e inactivó al 31% de fagos añadidos al
medio. Otro tenía como objetivo la proteína de unión al receptor, y la inactivó un 86%.
Las proteínas llamadas DARPins son polímeros diseñados con
monómeros de ankarina (designed ankyrin repeat proteins). Éstas
proteínas se unen específicamente a la punta de la proteína de unión al
receptor del fago de Lactococcus sp.

Finalmente y pese a todo, en los ambientes dinámicos en los que se
encuentra la industria láctea, los fagos acaban desarrollando
mecanismos de defensa. Por eso es necesario estudiar su genética junto a la de su hospedador(26).

3.4. Aislamiento y caracterización de mutantes resistentes
Con un método de cultivos secundarios, se aislaron variantes resistentes a fagos de forma
espontánea de Lb. delbrueckii, raspando en agar MRS colonias aisladas. Su resistencia se comprobó
sembrándolas con fago lítico, y comprobando que crecen normalmente(29).

Con Lb. helveticus, empleado para la fabricación del queso, se determinó la EOP, la estabilidad de
la resistencia al fago, y los ratios de lisogenia y adsorción, para caracterizar satisfactoriamente
fenotipos de resistencia de los aislados. Pese a la simpleza y rapidez del
método, es un caso aislado de Lactococcus sp. aplicables en el ámbito
comercial, porque los mutantes insensibles a fagos de este género, exhiben
comúnmente cualidades negativas en las fermentaciones lácteas(20).

Por otra parte, al amplificar por PCR el gen de la subunidad 16S de rRNA
(figura 14), se puede confirmar la identidad de mutantes a nivel de
subespecie. La secuenciación de éste rRNA es una herramienta valiosa para
estudiar comunidades de bacterias en ecosistemas de quesos(17). El
análisis RAPD-PCR se utiliza para determinar la diversidad genética de mutantes, y entre las cepas
parentales(20).

4. PRODUCCIÓN DE BACTERIOCINAS
Un ejemplo de aplicación de vectores de BAL es la producción de bacteriocina, un tipo de péptidos
bactericidas producidos por bacterias Gram-(+) y Gram-(-)(7,8,9) que se usan como agentes
preservantes de alimentos. Junto al ácido láctico, bajan el pH con lo que se protegen los alimentos
de infecciones por microorganismos patógenos(14).

Para su producción, se determinó con el protocolo de Plackett–Burman, que la lactosa y la
temperatura son los factores más importantes en la producción de bacteriocina: la composición
óptima de lactosa fue de 14.85 g/L, y a una temperatura de 25.59°C aumenta 8 veces la actividad de
bacteriocina en una fermentación de 18 h(4). A continuación se plantea la producción de pediocina
PA-1, y se plantean otras aplicaciones de bacteriocinas.

4. 1. Diseño de la producción de pediocina PA-1 asociada a la nisina
El análisis de la secuencia de nucleótidos (anexo 5) con EMBOSS(34) de un fragmento de 5,6 kB
correspondiente a la seceuencia de pediocina PA-1 (figura 15), indicó la presencia de cuatro marcos
de lectura abiertos (ORF) agrupados (PedA, PedB, PedC y PedD).

Un análisis de mutación mostró que PedA es el gen funcional de la pediocina PA-1; el PedB no está
involucrado en la producción de pediocina PA-1; el PedC codifica para una proteína relativamente
grande que se requiere para la producción de
pediocina PA-1 en E. coli; y el PedD muestra
fuertes similitudes con varias proteínas de
transporte dependientes de ATP, y con las
necesarias para inducir la competencia para la
transformación genética en S. pneumoniae,
por lo que puede estar implicado en la
translocación de pediocina PA-1(12).

La producción de pediocina PA-1 acompañada
de nisina, se asocia con la presencia del
plásmido pSRQ11 de 9,4 kb en Pediococcus
acidilactici PAC1.0(12). Sus fragmentos de
restricción se visualizan en la figura 16.

La enzima de restricción (ER) utilizada es EcoRI (figura 17), y los fragmentos que corta en la
pediocina PA-1 se visualizan en el anexo 6. Se demostró por subclonaje de pSRQ11 en E. coli que
dicho procariota puede producir PA-1 y secretarla.

Un análisis de supresión mostró que se
requiere un fragmento de 5,6 kB SalI-EcoRI
derivado de pSRQ11 para la producción de
pediocina PA-1(12). En este diseño se utiliza
EcoRI, porque es la única ER que corta en una
secuencia no codificante del gen de la
pediocina PA-I en Pediococcus acidilactici(13).

El operón de cuatro genes (PedA-D) requerido para la producción de pediocina se puede clonar en
el vector de expresión nisina inducible pMSP3535H3, corriente abajo de los promotores
endógenos(31), y con modificaciones iniciales al promotor de la nisA y la región de control del
número de copias como resultado el vector pMSP3535H2, seguido por la inserción del gen de la
inmunidad a la nisina, nisI, se forma el vector pMSP3535H3(31). El vector resultante tiene expresión
aumentada de pediocina en S. thermophilus, L. lactis subsps. lactis y casei(6), y su construcción se
ilustra en el anexo 7.

El vector pUC18 se puede adquirir de Life Technologies Inc., y pPC418 se construye de acuerdo a
una estrategia previamente descrita recogida en el anexo 8. La transformación de las células de E.
coli compententes OMNIMAX ™ 2 resistentes químicamente al fago T1, se lleva a cabo por un
método de choque térmico. La transformación de células de S. thermophilus ST128, L. lactis subsp.
lactis y L. lactis subsp. casei ML3 C2 se realiza por electroporesis estándar. Los transformantes se
seleccionan inicialmente según tengan plásmido recombinante por PCR según la tabla 2. Se ha
demostrado que se expresa en BAL como S. thermophilus y Lc. lactis(31).

4. 2. Otras aplicaciones de bacteriocinas
La producción heteróloga de bacteriocinas en otros hospedadores podría constituir una alternativa
válida para evitar patologías relacionadas con la contaminación de microbios patógenos(51). Otros
ejemplos de bacteriocinas transfectables de forma heteróloga son la lactacina A(6), B, y F(4), la
enterocina P(6), la acidocina 8912 y la enterolisina A(52).

Se han expresado y secretado a través de la lactocina quimeras de pediocina PA-1 fusionada a los
péptidos señal de lactocina A o enterocina P(6).

Respecto a las lactacina B y F, la acidocina 8912, son
producidas por ciertas cepas de L. acidophilus como.
L. gasseri LA39 (figura 18), que por su parte es
capaz de producir gasericina A, una bacteriocina
inhibitoria del crecimiento de patógenos potenciales
en productos fermentados(4).

En cuanto a la enterolisina A madura (EnlA), es de
interés al ser una bacteriocina lábil de clase III,
sintetizada por Enterococcus faecalis, como una
proproteína que rompe la PC de bacterias Gram-(+)
incluyendo Lc. lactis(52). Pueden desarrollarse cepas
de Lc. lactis subsp. cremoris NZ9000 y Lc. lactis
subsp. lactis IL1403 que produzcan de forma
heterogénea la EnlA para inducir la lisis controlada, y
la liberación de enzimas intracelulares que pueden
producir ACE-IP, una proteína en LD bovina (BSM) de interés inmunitario que se comentará a
continuación(52).

El clonaje del gen enlA de la enterolisina A (EnlA) se diseña desde Enterococcus faecalis DAC9,
mediante la expresión de la proteína codificante pMLG2 del vector plasmídico pMSP3545, y bajo
el control del promotor inducible PnisA. Se expresa de forma heteróloga como EnlA maduro en
BAL como Lc. lactis subsp. cremoris NZ9000 y Lc. lactis subsp. lactis IL1403(52).

Además de la producción de bacteriocinas por microorganismos iniciadores, los componentes
inmuno-moduladores en la leche fermentada pueden tener su origen directamente en los
componentes metabólicos de la misma leche(8).

5. MEJORA EN LA PRODUCCIÓN DE LACTATO Y AROMAS EN FERMENTACIONES
5. 1. Producción de diacetilo
El diacetilo es un ingrediente aromático en natas, en mantequillas evita que su fermentación sea
costosa debido a su lentitud, y da el olor a mantequilla característico, y puede encontrarse en
carvezas y vinos, a veces considerado contaminante(43), aunque en algunos es característico
(Scottish Ales, muy pocas Lagers como la Pilsner Urquell(44)). Ésto se puede conseguir añadiendo
genes de la citrato permeasa (CP, enzima implicada en translocar el citrato del medio al interior
celular de las BAL de interés), y genes de la acetolactato sintasa (ALS, figura 19, metaboliza el
acetato a diacetilo). Así, podemos aumentar la producción de diacetilo en la mantequilla, haciéndola
más ácida y, con esto, que sea agradable al paladar(14).

Los genes de la CP y la ALS se pueden integrar en un plásmido dual que contenga un plásmido
críptico de BAL, y otro con el gen de interés procedente de una especie fácil de cultivar y hacer
crecer en el laboratorio, como E. coli. Ejemplos de
plásmidos resultantes son los PWC: pW, pS y pP. Éstos
contienen un promotor fuerte procedentes del fago T7 que
sirve tanto para los genes de la CP como para los de la
ALS (es decir, están en un “cassette“ de expresión)(14).

Al batir algunas natas fermentadas, se rompen sus
glóbulos grasos, aglomerándose como grasa por fuerzas
de Van der Waals, de forma que obtenemos una nata
incompleta porque sólo queda suero ácido. Este suero es
la mazada de mantequilla, que conserva hasta un 2% de
agua y algunos aromas de fermentación(14).

Producir diacetilo en altas concentraciones con BAL modificadas genéticamente, permite que al
inyectarlo sobre leche desnatada (LD) dulce, obtengamos una mantequilla de calidad. De hecho en
Suiza se produce mantequilla con un variante de bacterias altamente productora desde hace quince
años(2). Hay algunas BAL para ello, que usan citrato como fuente de carbono, y lo transforman en
diacetilo: Leuconostoc cremoris, Lc. cremoris, Pediococcus sp.(14).

5. 2. Producción de acetaldehido
El acetaldehido es un ingrediente de leches fermentadas, da el frescor a los yogures, y puede
producirse por BAL como Lb. bulgaricus. Podemos modificar convenientemente plásmidos para
transfectarlos en BAL, y así aumentar la generación de diacetilo y acetaldehido, con el consiguiente
incremento en el aroma del producto láctico resultante. Ésto se puede lograr simplemente
introduciendo un promotor activo más fuerte(14).

6. MODULACIÓN DE LA ACTIVIDAD IMUNITARIA MEDIADA POR PROBIÓTICOS
Otra aplicación de interés, fuera del ámbito de la alimentación, es su efecto intensificador de la
actividad inmunitaria en vacunas como la poliomielitis y la influenza(16), y en la mucosa
intestinal(1,2). El uso de cepas de Lactobacillus que actúan como coadyuvantes mejorando la
respuesta a Acs de la vacuna de la poliomielitis(18).

Respecto a la influenza, infección respiratoria viral aguda con significante mortalidad en adultos de
mediana edad, la inmunidad adaptativa debe ser inducida a priori con una vacuna, pero tiene una
efectividad clínica limitada(17). Para mejorar su respuesta se propuso usar una cepa de Lb.
fermentum CECT5716 cuya seguridad alimenticia está comprobada(16), para estimular al sistema
inmunitario asociado a la mucosa gástrica, que es el mayor compartimento inmunitario del
cuerpo(52). Su consumo indujo un incremento en los niveles de IgA que reducían los casos de
diarrea, y de las células NK, propio de proteínas y oligosacáridos presentes en leche humana desde
la cual procede también esta bacteria. El desarrollo de síntomas propios de enfermedades
relacionadas con la influenza (ILI) en los pacientes que consumieron probióticos fue menor que en
los individuos que se vacunaron sin ellos, demostrando su efecto potenciador(17).

7. OTRAS APLICACIONES
En este apartado se comentará brevemente la implicación de BAL como probióticos para producir
ingredientes como lantibióticos, como vectores para tratar la hipertensión, y finalmente para la
producción de otros ingredientes.

Una aplicación es proteger quesos mediante lantibióticos (péptidos inhibidores del crecimiento de
hongos y levaduras) que impiden el enmohecimiento de su cubierta, porque es un inhibidor de la
esporulación. Es clave para evitar quese contaminen de Clostridium sp., que les da el olor a podrido
(ácido sulfhidrílico), pasteuriza a baja temperatura (72ºC) y sus esporas resisten al tratamiento
térmico del queso. Lantibióticos como la nisina se encuentran en la cera amarilla de sus cubiertas(14).
En cuanto al tratamiento de la hipertensión, se han desarrollado cepas de Lc. lactis recombinante, en
el cual se libera mediante una lisis controlada, un inhibidor de la enzima convertidora de
angiotensina (el ACE-IP), para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares (ECV) o en casos
de alta presión vascular (HTA), y peude ser incluído en el desarrollo de alimentos funcionales con
propiedades antihipertensivas(52).

Para concluir quisiera también mencionar la producción industrial mediante BAL de productos
panarios, chorizo, salchichas, y en general todos los embutidos cuya forma de presentación los
protege del pH, la fermentación maloláctica en vinos, espesantes para mejorar la untuosidad con
hexopolisacáridos, de goma xantano, raminosa, espesantes, reducción del colesterol, tratamiento de
diarreas(53), e incluso se investigan péptidos para luchar contra enfermedades(14) como la hemofilia
(yogures con lactoferrina bovina, que además dificulta el crecimiento de patógenos como Shigella
sp.)(1) y otros aditivos de interés(14).

8. FUENTES, AISLAMIENTO, CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN DE PROBIÓTICOS
Se han encontrado probióticos en Kurut (leche fermentada China de un pariente de las ovejas, el
Yak), kéfir, leche Masai, Koumiss (leche fermentada); alimentos fermentados nigerianos; quesos
italianos, búlgaros (eficacia demostrada en campesinos longevos(54)) y argentinos; mucosa colónica
y heces humanas; estómago de cerdos, ratas, aves de corral, abejas, peces de agua dulce y salada,
trucha arcoiris y camarón; carne, frutas, aceitunas verdes de Aloreña, productos en escabeche(3), y
constitutivos de la primera barrera microbiológica frente a la infección por patógenos intestinales y
urogenitales como Lactobacillus sp., de función antialergénica(55).

Las cepas más frecuentemente usadas (y demostradas) como probióticos son pues aisladas
principalmente de productos fermentados tradicionales, estómagos, heces, y leche materna. La
desnaturalización en grandiente en gel de electroforesis, gradiente de temperatura en el mismo, e
hibridación fluorescente in situ, son ejemplos de métodos moleculares para identificar y caracterizar
probióticos. Examinar el genoma entero, acelera el descubrimiento de nuevas funciones
probióticas(3).

Es necesario desarrollar métodos para relacionar la divesidad estructural y el funcionamiento del
complejo ecosistema de los productos lácteos con probióticos.

Han resultado especialmente destacados la caracterización de probióticos mediante detección del
rRNA 16s, la capacidad actual de clonar largos fragmentos, para crear librerías metagenómicas que
facilitan la modificación de nuevas BAL útiles en la alimentación, y los avances relevantes en
cuanto al conocimiento de la interacción con sus consumidores, los huéspedes de las BAL.

La aproximación combinando el perfil genético de los ribosomas 16s puede relacionar la estructura
con la función en el ecosistema. Destaca también la aplicación de microchips de oligonucleótidos
en ecología microbiana de quesos, que podría beneficiar el desarrollo de futuros probióticos(24).

La habilidad de clonar largos fragmentos de DNA metaagenómico permite señalizar operones
enteramente funcionales para recuperar hasta rutas metabólicas enteras. Pronto será posible predecir
la formación de sabor de varias BAL, y en segundo lugar encabezar el diseño de escaneos y
selección de cepas(24).

Generar y analizar librerías metagenómicas es una aproximación poderosa para cultivar y archivar
recursos genéticos ambientales. Puede ser útil identificar los organismos presentes en ecosistemas
de quesos, qué hacen, y cómo su información genética puede ser útil para la humanidad(24).

Entender los mecanismos de reconocimiento de los probióticos con sus hospedadores permite una
selección adecuada de probióticos y puede permitir el desarrollo de nuevas funciones probióticas(2).

CONCLUSIONES
Debido al elevado valor nutricional de la leche y los productos lácteos, puesto que proporcionan
multitud de nutrientes de alto valor biológico (proteínas, grasa, CH como la lactosa, vitaminas
liposolubles, y minerales como el Ca2+), resulta de gran interés industrial el desarrollo de cepas de
BAL modificadas genéticamente mediante plásmidos u otros vectores, para mejorar la producción
de productos lácteos con beneficios funcionales, entre los que destaca la mejora del sistema
inmunitario del hospedador debido a que muchas tienen una relación de simbiosis con sus
hospedadores naturales.

Las BAL se pueden modificar genéticamente para prevenir la acción de los patógenos en tanto al
producto lácteo, como al hospedador que consuma el producto de sus fermentaciones. Éstas
modificaciones involucran:
• La resistencia a fagos.
◦ A nivel de su adsorción.
◦ Portando genes que lleven a su muerte si son infectadas (evitan la proliferación del fago).
◦ Digiriendo el material genético del fago.
• La producción de un amplio rango de agentes preservantes de alimentos.
◦ Bacteriocinas.
◦ Lantibióticos.

Finalmente, las BAL consideradas como GRAS, cuando son transformadas genéticamente, pueden
mejorar sus características como probióticos, por lo que suman alguno de sus efectos beneficiosos
al subproducto en el que estén asociadas:
• Mejoran la producción de lactato, aromas y propiedades biofísicas deseables en
fermentaciones de utilidad en la industria láctea asociados a la presencia de diacetilo y
acetaldehido.
• Pueden tener aplicación clínica en enfermedades como la hipertensión arterial, o la mejora
en la respuesta a la vacuna de la influenza.

CONCLUSIONS
Milk and its lactic products provide a wide range of high biological value nutrients. These include
proteins, fat, carbohydrates such as lactose, lipid soluble vitamins, or minerals like calcium.
Because of that, the development of genetic engineering LAB strains via plasmids or other vectors
is interesting in the dairy industry as they enhance in the beneficial dairy products. This is because
they enhance the host inmune system due to their symbiotic relationship with the host.
The LAB can be genetically modified in order to prevent pathogenic proiferation, both in the dairy
product and their host. These modifications involve:
• Phage resistance
◦ Related to theur adsortion
◦ Via cell death when infected
◦ Via phage DNA digest
• The production of a wide range of food preserver agents
◦ Bacteriocins
◦ Lantibiotics

To conclude, when the GRAS LAB are genetically transformed, they can enhance their probiotic
characteristics, so they add some beneficts to the associated dairy product:
• They enhance lactic acid production, their aroma, and desired biophysics properties in useful
dairy industry fermentations, which are associated to diacetyl and diacetaldehyde.
• They can be included in clinical treatments such as hypertension or the influenza
vaccination.

REFERENCIAS
1. Saito T. Selection of useful probiotic lactic acid bacteria from the Lactobacillus acidophilus
group and their applications to functional foods. Anim Sci J. 2004;75:1-13.
2. Bermudez-Brito M, Plaza-Díaz J, Muñoz-Quezada S, Gómez-Llorente C, Gil A. Probiotic
Mechanisms of Action. Ann Nutr Metab. 2012;61:160-174.
3. Fontana L, Bermudez-Brito M, Plaza-Diaz J, Munoz-Quezada S, Gil A. Sources, isolation,
characterisation and evaluation of probiotics. Br J Nutr. 2013;109:S35–50.
4. Hwanhlema N, Chobertb JM, H-Kittikuna A. Bacteriocin-producing lactic acid bacteria isolated
from mangrove forests in southern Thailand as potential bio-control agents in food: Isolation,
screening and optimization. Food Control. 2014 Jul;41:202-11. |
dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodcont.2014.01.021
5. Gútiez L, Borrero J, Jimenez JJ, Gomez-Sala B, Recio I, Cintas LM, Herranz C, Hernandez PE.
Controlled enterolysin A-mediated lysis and production of angiotensin converting
enzymeinhibitory bovine skim milk hydrolysates by recombinant Lactococcus lactis. Int Dairy J.
2014 Jan;34:100-3.
6. Primrose SB, Twyman RM. Principles of Gene Manipulation and Genomics. Blackwell. 2006;7.
7. Klaenhammer T. Genetics of bacteriocin produced by lactic acid bacteria. FEMS Microbiol Rev.
1993;12:39-86.
8. Jack R, Tagg J, Ray B. Bacteriocins of Gram positive bacteria. Microbiol Rev. 1995;59:171-200.
9. Nes I, Diep D, havarstein L, Brurberg M, Eijsink V, Holo H. Biosynthesis of bacteriocins in lactic
acid bacteria. Antonie van eeuwenhoek. 1996;70:113-26.
10. Coderre PE, Somkuti GA. Cloning and Expression of the Pediocin Operon in Streptococcus
thermophilus and Other Lactic Fermentation Bacteria. Curr Microbiol. 1999;39:295-301.
11. Riley M, Wertz J. Bacteriocins: Evolution, Ecology, and Application. Annu Rev Microbiol.
2002;56:117-37.
12. Marugg JD, Gonzalez CF, Kunka BS, Ledeboer AM, Pucci MJ, Toonen MY, Walker SA,
Zoetmulder LCM, Vandenbergh PA. Cloning, expression, and nucleotide sequence of genes
involved in production of pediocin PA-1, a bacteriocin from Pediococcus acidilactici PAC1.0.
Appl Environ Microbiol. 1992;58(8):2360-7.
13. Karakas A, Narbad A, Horn N, Dodd H, Parr A, Colquhoun I, Gasson M. Post-translational
modification of nisin. Eur J Biochem. 1999;261:525.
14. Gil A. Comentario personal.
15. Fonseca F, Marin M, Morris GJ. Stabilization of Frozen Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus in Glycerol Suspensions: Freezing Kinetics and Storage Temperature Effects. Appl
Environ Microbiol. 2006 Oct; 72(10): 6477.
16. Gil-Campos M, Lopez MA, Rodriguez-Benitez MV, Romero J, Roncero I, Linared MD et al.
Lactobacillus fermentum CECT 5716 is safe and well tolerated in infants of 1-6 months of age: A
Randomized Controlled Trial. Pharmacol Res. 2012;65:231-8.
17. Olivares M, Diaz-Ropero MP, MBS, Sierra S, lara-Villoslada F, Fonolla J, Navas M, Rodriguez
JM, Xaus J. Oral intake of Lactobacillus fermentum CECT5716 enhances the effects of influenza
vaccination. Nutrition. 2007;23:254-60.
18. de Vrese M, Rautengerg P, Laue C, Koopmans M, Herremans T, Schrezenmeir J. Probiotic
bacteria stimulate virus specific neutralizing antibodies following a booster polio vaccination.
Eur J Nutr. 2005;44:406-13.
19. Garneau JE, Moineau S. Bacteriophages of lactic acid bacteria and their impact on milk
fermentations. Microbial Cell Factories. 2011;10(1):S20.
20. Rodriguez A, Madera C, Suarez JE. Los virus de las bacterias lacticas: influencia sobre la
fabricacion de alimentos fermentados (no hay enemigo pequeño). CSIC Asturias. 2011 Nov;15:4.
21. Ainsworth S, Zomer A, Mahony J, van Sinderen D. Lytic Infection of Lactococcus lactis by
Bacteriophages Tuc2009 and c2 Triggers Alternative Transcriptional Host Responses. Appl
Environ Microbiol. 2013 Aug;79(16):4789.
22. Chopin M-C, Chopin A, Bidnenko E. Phage abortive infection in lactococci: variations on a
theme. Curr Opin Microbiol. 2005 Aug;8(4):473-9.
23. Lujan MC. Bacteriofagos de Lactobacillus casei/paracasei. Caracterizacion y estudio de la
fagorresistencia. Tesis Doctioral UNL. 2007:71-2.
24.. Randazzo C L, Caggia C, Neviani E, Application of molecular approaches to study lactic acid
bacteria in artisanal cheeses. J Microbiol Methods. 2009;78:1-9.
25. de Lima CP, Bruno LM, de Figueiredo EAT, del Lujan A, Carvalho JDG, de Carvalho AKF.
Phage resistance of acid lactic bacteria isolated from Coalho cheese industries. Cienc Rural.
2012 Jun;42(6):1117-22.
26. Allison GE, Klaenhammer TR. Phage resistance mechanisms in lactic acid bacteria. Int Dairy J.
1998 Mar;8(3):207-26.
27. Binetti AG, Suarez VB, Tailliez P, Reinheimer JA. Characterization of spontaneous phage
resistant variants of Streptococcus thermophilus by randomly amplified polymorphic DNA
analysis and identification of phage-resistance mechanisms. Int Dairy J. 2007;17:1115-22.
28. Labrie SJ, Samson JE, Moineau S. Bacteriophage resistance mechanisms. Nat Rev Microbiol.
2010 May;8:317-27.
29. Reinheimer JA, Morelli R, Callegari ML, Bottazzi V. Phage resistance in Lactobacillus
helveticus CNRZ 328. Microbiol Aliments Nutr. 1993;11:235-40.
30. Youle M, Schaechter M. Six questions about CRISPRs. ASMscience. 2011 Apr.
31. Renye JA, Somkuti GA, Garabal JI, Du L. Heterologous production of pediocin for the control
of Listeria monocytogenes in dairy foods. Food Control. 2011 Dec;22(12):1887–92.
32. Secuencia de la pediocina PA-1 (PedA): M83924.1. | ebi.ac.uk/ena/data/view/M83924
33. EcoR1. | thermoscientificbio.com/restriction-enzymes/ecori/
34. Emboss. | emboss.bioinformatics.nl/
35. Raz Y, Tannenbaum E. The Influence of Horizontal Gene Transfer on the Mean Fitness of
Unicellular Populations in Static Environments. Genetics. 2010 May;185(1):328.
36. Rul F, Ben-Yahia L, Chegdani F, Wrzosek L, Thomas S, Noordine M-L, Gitton C, Cherbuy C,
Langella P, Thomas M. Impact of the Metabolic Activity of Streptococcus thermophilus on the
Colon Epithelium of Gnotobiotic Rats. J Biol Chem. 2011 Mar; 286(12): 10292.
37. Barrangou R, Philippe Horvath P. Lactic Acid Bacteria Defenses Against Phages. Food
Microbiol and Food Saf. 2011:459-478.
38. Kolatka K, Kubik S, Rajewska M, Konieczny I. Replication and partitioning of the broadhostrange
plasmid RK2. Plasmid. 2010 Nov;64(3):120.
39. Birkeland M-K, Holo H. Transduction of a Plasmid Carrying the Cohesive End Region from
Lactococcus lactis Bacteriophage LC3. Appl Environ Microbiol. 1993 Jun;59(6):1967.
40. Chapot-Chartier M-P, Vinogradov E, Sadovskaya I, Andre G, Mistou M-Y, Trieu-Cuot P, Furlan
S, Bidnenko E, Courtin P, Pechoux C, Hols P Dufrene YF, Kulakauskas S. Cell Surface of
Lactococcus lactis is Covered by a Protective Polysaccharide Pellicle. Biol Chem. 2010 Apr;
285(14): 10467.
41. Mosavi LK, Minor DL, Peng ZY. Consensus-derived structural determinants of the ankyrin
repeat motif. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99:16029-34.
42. Holmes KL, Culver GM. Analysis of Conformational Changes in 16 S rRNA During the Course
of 30 S Subunit Assembly. J Mol Biol. 2005 Nov;354(2):347.
43. Sakamoto K, Konings WN. Beer spoilage bacteria and hop resistance. Int J Food Microbiol.
2003 Dec 31;89(2-3):105-24.
44. Aparicio R. Diacetilo: su produccion y reduccion. Revista Mash. 2010 Apr 19. |
revistamash.com/detalle.php?id=367
45. Bergey DH. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 1923;1.
46. Vinderola G, Briggiler M, Guglielmotti DM, Perdigon G, Giraffa G, Reinheimer J, Quiberoni A.
Phage-resistant mutants of Lactobacillus delbrueckii may have functional properties that differ
from those of parent strains. Int J Food Microbiol. 2007;116:96-102.
47. Landete JM, Peiroten A, Rodriguez E, Margolles A, Medina M, Arques JL. Anaerobic green
fluorescent protein as a marker of Bifidobacterium strains. Int J Food Microbiol. 2014
Apr;175:6-13. | dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2014.01.008
48. Oddone GM, Mills DA, Block DE. Incorporation of nisI-mediated nisin immunity improves
vector-based nisin-controlled gene expression in lactic acid bacteria. Plasmid. 2009;61:151-8.
49. Solioz M, Bienz D. Bacterial genetics by electric shock. TIBS. 1990;15:177.
50. Apuntes bioquimica experimental II.
51. Gutierrez J. Caracterizacion inmunoquimica de la enterocina P y evaluacion de su clonacion,
produccion y expresion funcional en Escherichia coli, Methylobacterium extorquens,
Lactococcus lactis y Pichia pastoris. Madrid: Memoria para optar al grado de doctor en
veterinaria. 2005;1:11-62. | biblioteca.ucm.es\tesis\vet\ucm-t28407.pdf
52. Ogra PL, Mestecky J, Lamm ME, Strober W, Brenenstock J, McGhee JR. Mucosal inmunology.
London: Academic Press;1999.
53. Tomo II: Composición y Calidad Nutritiva de los Alimentos. Gil A. Tratado de Nutrición. Tomo
II: Composición y Calidad Nutritiva de los Alimentos. Madrid: Panamericana. 2010;2.
54. Hume ME. Historic perspective: prebiotics, probiotics, and other alternatives to antibiotics.
Poult Sci. 2011;90:2663–9.
55. Martin R, Olivares M, Marin ML, Fernandez L, Xaus J, Rodriguez JM. Probiotic Potential of 3
Lactobacilli Strains Isolated From Breast Milk. J Hum Lact. 2005;21(1):8-17.

Licencia de Creative Commons
Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial 4.0 Internacional.

1 comentario:

theDruid dijo...

Muy bueno ! gracias.